Technology Webinars   http://webinar.sciencemag.org/all-webinars/Technology

 

 

written by Theo Bond

A paper recently published in Nature by a group from the Spanish National Cancer Research Centre (CNIO) has shown that it is possible to create induced pluripotent stem cells in vivo.

iPSCs were first created in 2006 by Shinya Yamanaka, for which he won the 2012 Nobel prize for Medicine, by using four transcription factors – Sox2Oct4Klf4 and c-Myc – in mice fibroblast in vitroto revert the cells back to a pluripotent state. The group from the Spanish National Cancer Research Centre (CNIO) used the same four factors in mice and produced in vivo teratomas from multiple organs, showing that full reprogramming had occurred.

Dedifferentiated cells were identified in the stomach, intestine, pancreas and kidneys; furthermore, these cells were expressing the pluripotency marker NANOG. The group also used reprogrammed hematopoietic cells in vivo and used these cells for a successful bone marrow transplant.

In addition to being able to reprogram cells to a pluripotent state in vivo, the group identified that the transcriptome of circulating iPSCs in the blood were closer to that of embryonic stem cells than standard in vitro-generated iPSCs. As well as being able to contribute to all three germ layers, the in vivo iPSCs could also contribute to the trophectoderm lineage, suggesting that these cells are totipotent rather than just pluripotent.

Manuel Serrano, who led the group and is the director of the Molecular Oncology Programme and head of the Tumoural Suppression Laboratory, described the results, saying: “This data tell us that our stem cells are much more versatile than Yamanaka’s in vitro iPSCs, whose potency generates the different layers of the embryo but never tissues that sustain the development of a new embryo, like the placenta.”

María Abad, a member of Serrano’s group and an author of the article, said: “This change of direction in development has never been observed in nature. We have demonstrated that we can also obtain embryonic stem cells in adult organisms and not only in the laboratory.”

“Our stem cells also survive outside of mice, in a culture, so we can also manipulate them in a laboratory,” explained Abad. “The next step is studying if these new stem cells are capable of efficiently generating different tissues such as that of the pancreas, liver or kidney.”

“We can now start to think about methods for inducing regeneration locally and in a transitory manner for a particular damaged tissue,” concluded Serrano.

Source: Abad M, Mosteiro L, Pantoja C et al. Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features. Nature doi:10.1038/nature12586 (2013) (Epub ahead of print); CNIO press release: www.cnio.es/es/news/docs/manuel-serrano-nature-11sep13-en.pdf

 

 

New self-renewing gene identified in hematopoietic stem cells

A group from the Princess Margaret Cancer Centre (ON, Canada) have published their findings in a recent issue of Nature Immunology, showing that the gene GATA3 regulates the self-renewal of long-term hematopoietic stem cells (HSCs).

The self-renewing ability of HSCs allows the use of bone marrow transplants to treat patients suffering from cancers of the blood or bone marrow, such as leukemia and multiple myeloma. However, trying to replicate the same conditions in the laboratory in order for HSCs to self-renew has been problematic; this is important as the number of stem cells influences the effectiveness, safety, availability and overall level of success of the bone marrow transplantation.

Norman Iscove, Senior Scientist at the Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network and lead author of the paper, explained: “Researchers have known for a long time that stem cells can increase their numbers in the body through self-renewal; however, it has proven very difficult to establish conditions for self-renewal in the laboratory.”

It had been previous shown that GATA-3 is expressed in HSCs but its role and function in the cell has remained unclear until now. The group identified that GATA-3 was expressed in the cytoplasm of quiescent long-term HSCs; however, when the cell started to go through the self-renewing cycle, the GATA-3 relocated to the nucleus due to signalling from p38, a MAPK. Knockdown of the GATA-3 gene in genetically engineered mice increase the self-renewal rate of HSCs and thereby results in increased numbers of the stem cells.

The findings suggest that GATA-3 acts downstream of the p38 signaling pathway in HSCs and is a key regulator in inducing self-renewal and differentiation. It is hoped that this discovery will improve the self-renewing ability of HSCs in the laboratory, increasing the efficiency of bone marrow transplants.

Sources: Frelin C, Herrington R, Janmohamed S et al. GATA-3 regulates the self-renewal of long-term hematopoietic stem cells. Nat. Immunol. 14(10), 1037–1044 (2013); Princess Margaret press release:www.uhn.ca/corporate/ForMedia/PressReleases/Pages/NormanIscove_PressRelease_GeneControls.aspx

 

 

 

Stem cells used to resynchronize cardiac motion following a heart attack

Researchers from the Mayo Clinic (MN, USA) have developed a way to resynchronize cardiac motion following a heart attack using induced pluripotent stem cells (iPSCs). Their findings were published in a recent issue of the Journal of Physiology.

Heart attacks can result in a condition known as cardiac dyssynchrony, caused by muscle damage that disrupts the normal heart conduction. The current standard of therapy for cardiac dyssynchrony is the use of pacemakers. However, some severe patients do not respond favorably to this treatment as they require a certain level of healthy cardiac muscle to provide the optimal outcome from pacemakers.

The group from the Mayo Clinic developed iPSCs from reprogrammed fibroblast cells. These were then delivered to areas of damaged cardiac tissue in post-myocardial infarction mice.

Satsuki Yamada, one of the authors of the paper, explained that, “A high-resolution ultrasound revealed harmonized pumping where iPSCs were introduced to the previously damaged heart tissue.”

The cells were monitored, and 10 days postinfarction the iPSCs had restored the contractility of targeted cardiac muscles, and prevented or normalized abnormal strain patterns.

“The discovery introduces – for the first time – stem cell-based ‘biological resynchronization’ as a novel means to treat cardiac dyssynchrony,” said Andre Terzic, lead author on the paper. “By harnessing the potential of regenerative medicine – repairing the injured heart, in this case – we will be increasingly able to provide more definitive solutions to our patients.”

The paper has shown for the first time that an iPSC-based treatment may be effective in synchronizing damaged cardiac muscle. Additional studies will need to be carried out to identify the value of iPSC-based regenerative solutions for abnormal cardiac motion in heart failure.

Sources: Yamada S, Nelson T, Kane G et al. iPS cell intervention rescues wall motion disparity achieving biological cardiac resynchronization post-infarction. J. Physiol. 591, 4335–4349 (2013); Mayo Clinic press release: www.mayoclinic.org/news2013-rst/7664.html

Adult Stem Cell Therapy Status: Summary and FDA Issues

By  Boyd Sorenson

 

 

Embryonic stem cells are often discussed in the media, but adult stem cell technology gets less coverage.  The article below is a primer on adult stem cell technology and therapy, with comments on a recent FDA ruling. Attorneys, pharma consultants and investors may be interested in the potential impact of adult stem cell technology and applications for future cases and opportunities.

 

 

  

Adult stem cells exist in all people and are naturally used by our bodies to repair and regenerate injured issue.  The generation and use of naturally occurring stem cells generally diminishes with age.   Adult stem cells differ from embryonic stem cells in that they are based on embryo or placenta materials, which have a much larger ability to adapt to specific body tissue and organs. There are many types of adult stem cells, but mesenchymal stem cells are considered the most useful.  Mesenchymal stem cells (MSC) can be harvested from tissue in the body rich in MSC, such as bone marrow or adipose tissue.


Typically in adult stem cell therapy, stem cells are harvested from the bone marrow, often from a patient’s hip, by aspiration.  They are then concentrated by centrifugation and mixed with blood platelets extracted from the patient’s blood; blood platelets are rich in natural growth factors and aid in the stem cell’s effectiveness.  The concentrated stem cells and blood platelets are combined and then precisely injected back into the damaged part of the body in need of regeneration.  Such procedures are usually done the in one day at an outpatient clinic with little discomfort to the patient.

The claims of positive results from adult stem cell therapy are huge, in areas such as: Repairing meniscus tears in the knee; repairing shoulder joint injuries; healing diabetic wounds; regenerating back tissue; regenerating heart tissue and valves; and reducing back pain.  There are also experimental reports of in vitro organ growth using adult stem cells, where a “constructed” organ is placed in the body to carry on normal functions.  The literature is replete with examples of marvelous outcomes with adult stem cells therapies that, while not nearly effective as embryonic stem cells therapies, sidestep the ethical and supply issues associated with embryonic cells. 

 

Adult stem cell therapy has FDA problems, however. For extensive coverage, click here.  In July of 2012, litigation involving Regenerative Sciences, LLC  as the defendant and the FDA, the United States District Court for the District of Columbia ruled in favor of the FDA.  The ruling essentially said the “Regenexx” procedure is a drug under the Federal Food, Drug, and Cosmetic Act and must comply with New Drug Application (NDA) regulations for current Good Manufacturing Practices (cGMP).  This issue has not been resolved, but Regenerative Science continues to practice the procedure on the “surgery exemptions “ of  CFR 21 Part 1271.15(b).  One basis of Regenerative’ s position is that “…patient’s cells are harvested in the morning, isolated and processed, then re-injected into the patient’s injured area – all within a period of a few hours.”  More elaborate adult stem cell procedures are practiced outside the United States to avoid FDA issues.  Many doctors believe the FDA is inhibiting successful client therapies and the science and medical breakthroughs of adult cell technology.  Some medical specialists imagine that medical device manufactures, such as those supplying spine, knee and hip replacement parts, lobby against adult stem therapy, seeing it as a disruptive technology.

 

 It is important to note that Dr. Shinya Yamanaka, a Japanese physician and researcher, won the Nobel Prize in Physiology (Medicine) in 2012 (along with Dr. John Gurdon) for the discovery that certain cells can be converted to cells closely resembling embryonic stem cells.  Recently, the Spanish National Cancer Research Centre (CNIO) reported that it has successfully treated adult stem cells in such a way as “…to recover the characteristics of embryonic stem cells.”  The research in stem cell medicine and science that circumvents the embryonic approach is intense. 

 

Finally, there is the equipment side of adult stem technology, whose growth is important to consider. One equipment leader is Harvest Technology Corp. located in Massachusetts but operating globally and owned the Japanese company Terumo  that specializes in blood management system and cardiac and vascular therapeutics.  Harvest provides point-of-care equipment for marrow aspiration, centrifuges to separate adult stem cells, and growth factors and disposables that are used in clinics.

 

Medical researchers and scientists, medical device specialists, and investors should keep a close eye on the progress, successes and acceptance, particularly by the FDA, of future adult stem cell technology and applications.

 

Additional information on this topic can be found in the videos below:

http://www.youtube.com/watch?v=OkS8ShmW7GQ or http://www.youtube.com/watch?v=L_8tmSw3UU8  

Research in stem cell technology has resulted in several recent stem cell innovations, including implanting engineered stem cells into cardiac patients following a heart attack to resynchronize cardiac motion and using pieces of DNA to reprogram adult tissue cells to a stem cell state.

 

 

Adult Stem Cell Therapy Status.doc
Microsoft Word документ 53.5 KB

           

Экзосома - механизм координации и взаимопомощи клеток организма.

 

Необходимым условием жизнедеятельности многоклеточного организма являются межклеточные взаимосвязи позволяющие скоординировать биохимические процессы, протекающие в его клетках. Для осуществления такой координации, дающей возможность сообществу клеток контролировать и направлять в нужном направлении поведение ее членов, требуются механизмы, которые позволяют обмениваться комплексной информацией на расстоянии. Шесть лет тому назад такой механизм был открыт при изучении микроскопических пузырьков выделяемых клетками во внеклеточную среду. Эти пузырьки, до последнего времени считавшиеся чем-то вроде мусорного бачка для удаления из клетки отходов жизнедеятельности, оказались бесценным кладом для будущей медицины!

 

Необходимым условием жизнедеятельности многоклеточного организма являются межклеточные взаимосвязи позволяющие скоординировать биохимические процессы, протекающие в его клетках. Такая межклеточная коммуникация даёт возможность сообществу клеток контролировать и направлять в нужном направлении поведение ее членов. Например, для превращения тканей  эмбриона в конкретные органы тела требуется тщательно скоординированное развитие. Необходимо чтобы клетки правильно посылали сигналы о себе и правильно реагировали на полученные ими сигналы. Неадекватная реакция на сигнал может привести к аномалиям развития и к таким заболеваниям, как рак. Сигналы могут передаваться с помощью таких веществ как гормоны, цитокины и хемокины, факторы роста, нейромедиаторы, различные метаболиты, ионы кальция, натрия, калия. Эта передача может осуществляться как путем секреции во внеклеточное пространство, так и через щелевые контакты и туннельные нанотрубки которые позволяют осуществлять электрические и метаболические связи между клетками [ [1]]. Однако вышеизложенные способы передачи сигнала предполагают либо тесный контакт между близлежащими клетками, либо довольно просты – они не позволяют обмениваться комплексной информацией на расстоянии. Как недавно, выяснилось, есть еще один способ передачи информации между клетками -  микроскопические внеклеточные везикулы - крошечные внеклеточные пузырьки, которые выделяют клетки различных тканей или органов в окружающую их среду. Попав в кровоток или какую-нибудь другую жидкость организма, они разносятся по всем, даже самым отдаленным частям тела.  Встретив клетку — адресата послания, они узнают ее с помощью молекул, расположенных на их поверхности, затем, попав внутрь клетки, сообщают ей, как живут-поживают клетки-отправители и что делать дальше ей самой.

Первоначально эти крошечные пузырьки-везикулы рассматривались как мусорный ящик - резервуар для удаления избытка клеточной цитоплазмы и считались побочным продуктом жизнедеятельности клеток [[2]]. С момента их открытия и до начала XXI века никто ими особенно не интересовался. Потом выяснилось, что они обладают способностью регулировать иммунные реакции организма. Когда же в 2007 году в них были обнаружены нуклеиновые кислоты — носители генетической информации, стало ясно, что это далеко не только мусорные контейнеры [[3]], а, пока недостаточно изученный, механизм координации и взаимопомощи  клеток организма.  

Благодаря тому, что эти пузырьки содержат многочисленные белки, липиды и нуклеиновые кислоты, они способны воздействовать на клетку- адресата гораздо более сложными способами, чем отдельные молекулы. Дополнительное удобство в том, что содержимое пузырька окружено мембраной, которая предохраняет его от воздействия среды. Рецепторы на поверхности мембраны обеспечивают доставку точно по адресу. Путешествуют такие «посылки» наиболее экономичным «водным транспортом» — с жидкостью, циркулирующей по кровеносным артериям и лимфатическим сосудам. Таким образом обеспечивается обмен информацией между удаленными клетками, в самых разных органах и частях тела.

Помимо переноса информации  внеклеточные везикулы могут участвовать и в механизмах «взаимопомощи» - доставлять  готовые белки необходимые «адресату». Например, внеклеточные пузырьки, называемые экзосомами, переправляют от нейронов к мышечным клеткам мембранный белок синаптотагмин 4. Он нужен для формирования нервно-мышечного соединения (синапса), через которое передаются электрические сигналы от нейронов к мышечным клеткам. Производится этот белок в нервных клетках, а используется в мышечных, так что без пересылки тут не обойтись [[4]]. 

 

Образование экзосом. Мембрана экзосомы образуется в результате впячивания внутрь мембраны ранней эндосомы. Белки, РНК, ДНК попадают внутрь экзосомы из цитоплазмы клетки, тогда как антигены сперва попадают в результате эндоцитоза в эндосому и уже там связываются на наружней поверхности экзосомы с белками главного комплекса гистосовместимости. Рецепторы экзосомы, очевидно, достаются ей «по наследству» от плазматической мембраны клетки. Судьба эндосомы зависит от маркировки её мембраны определёнными липидами: если она помечена лизобисфосфатидиловой кислотой (красные точки), то её содержимое будет уничтожено, а если церамидами — вытолкнуто из клетки наружу. Руководят этими процессами ГТФазы Rab, Различные члены этого семейства белков выполняют разные функции: Rab5 руководит образованием эндосомы, Rab7 организует деградацию содержимого мультивезикулярной эндосомы в лизосоме, а Rab11, Rab27 и Rab35 необходимы для секреции экзосом во  внеклеточное пространство. Показано, что экзосомы содержат порядка 4000 различных белков, более 1500 разных микроРНК и мРНК, а также ДНК   Внизу — «обобщенная» экзосома в увеличенном виде.

 

 

 

Классификация и механизмы образования внеклеточных везикул

В зависимости от того, как образуются внеклеточные пузырьки и какой они величины, их называют апоптозными тельцами, эктосомами или экзосомами.

Апоптозные тельца, они же апотельца, — это ограниченные плазматической мембраной фрагменты клетки, образующиеся в результате апоптоза — регулируемой организмом самоликвидации клетки. Они имеют размер около 50—5000 нм в диаметре и могут содержать органеллы или даже фрагменты ядра погибшей клетки.

Эктосомы, или почкующиеся микровезикулы, образуются путем выпячивания плазматической мембраны из клетки наружу; выпуклость отшнуровывается от мембраны клетки и превращается в пузырек. Это довольно крупные пузырьки — обычно от 50 до 200 нм, но иногда достигают и 1000 нм в диаметре.

Экзосомы — небольшие пузырьки (обычно от 40 до 100 нм). Первоначально они образуются внутри клетки — почкуются в полость, называемую эндосомой. Когда в этой полости накапливается достаточно много экзосом, дальнейшая ее судьба зависит от того, какими липидами промаркирована ее мембрана. Если эндосома помечена лизобисфосфатидиловой кислотой (фосфатидилинозитол-3-фосфат) и содержит убиквитинированные белки, то ее содержимое будет уничтожено — она сольется с лизосомой, мембранным пузырьком, наполненным ферментами, которые расщепляют белки, углеводы, липиды и нуклеиновые кислоты. Если же мембрана эндосомы содержит церамиды — это сигнал «отправить почту»: эндосома сливается с поверхностной мембраной клетки и множество экзосом выталкивается наружу, во внеклеточную среду (см. рисунок). Руководят этими процессами небольшие ГТФазы (ферменты, которые связывают и гидролизуют гуанозинтрифосфат) семейства Rab. Различные члены семейства белков Rab выполняют разные функции: Rab5 руководит образованием эндосомы, Rab7 организует деградацию содержимого мультивезикулярной эндосомы в лизосоме, а Rab11, Rab27 и Rab35 необходимы для секреции экзосом во внеклеточное пространство.

Механизм поглощения клетками млекопитающих экзосом пока изучен слабо. Этот механизм включает  эндоцитоз, активируемый экзосомой путем фосфорилирования  внеклеточной регулируемой киназы-1/2 (ERK1/2) передающей этот сигнал на белок теплового шока 27 (HSP27). Процесс эндоцитоза негативно регулируется белком кавеолин-1 [[5]].

Экзосомы и эктосомы были обнаружены в самых разных полостных жидкостях организма, их можно найти и в моче, и в сперме, сыворотке крови, лимфе, слюне, слезах, выделениях из носа, в желчи, околоплодных водах и даже в грудном молоке. Производить экзосомы, как теперь известно, способна почти любая наша клетка — от клеток желудочно-кишечного тракта и желез внутренней секреции до клеток кожи и мозга.

 

Характеристики экзосом, микровезикул (эктосом) и апоптозных телец

 

Как следует из таблицы, РНК, имеющие регуляторные функции, характерны в основном экзосомам, что доказывает их первоочередное значение в деятельности по координации клеточного сообщества организма.

Способностью к секреции экзосом обладают все многоклеточные и даже некоторые, организованные в сообщества, одноклеточные организмы. Очевидно, этот механизм коммуникации с целью взаиморегуляции столь важен, что не подвергся существенным изменениям в процессе эволюции [[6]]  

Поэтому далее мы сосредоточимся на описании именно этих везикул.

 

Методы выделения экзосом

Обычно очистка экзосом включает несколько последовательных стадий центрифугирования, позволяющих избавиться от клеток и фрагментов ткани. В каче­стве дополнительной стадии очистки используют выделение экзосом в градиенте плотности (экзосомы концентрируются  в диапазоне от 1,13 г/мл до 1,19 г/мл градиента).

Простая, не требующая ультрацентрифугирования методика получения экзосом с помощью препарата «ExoQuick» была разработана американской компанией «System Biosciences». Несмотря на заявленную эффективность, препарат, согласно отзывам пользователей, приводит к осаждению не только экзосом, но и других частиц, что затрудняет его использо­вание. Чтобы преодолеть этот недостаток  компания Cell Guidance Systems выпустила специальные хроматографические колонки «Exo-spin» для  выделения высокоочищенных экзосом из крови за 1-2 часа. Пока эти колонки предназначены только для исследовательских целей. (http://www.cellgs.com/Downloads/1280/ex-02_user_guide.pdf)

Следует отметить, что пока нет единого стандартного способа выделения, и способы очистки экзосом из разных объектов различаются хотя бы потому, что требуют разного подхода.  Ниже в таблице приведены наиболее распространенные методы получения экзосом.

 

Некоторые методы выделения экзосом (по Marcus  & Leonard, 2013).

Способ выделения

Преимущества

Недостатки

Источник

Дифференциальное

центрифугирование

 

Потенциально высокий выход

Стерильные

 

Трудоемкий

Выход зависит от опыта и умения  лаборанта

[ [7], [8]]

 

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ, англ. HPLC) +

центрифугирование

Высокая пропускная способность

Трудоемкий

Длительный

Низкий выход

[ [9]]

 

Аффинные бусинки

Высокая пропускная способность

Меньше операций, чем у методов центрифугирования

 

Избирательно выделяется только определенная популяция экзосом (те, чьи белки распознали антитела бусинок)

Трудность полного удаления

антител из образца

 

[7]

 

Осаждение полимерами

 

Потенциально высокий выход

Меньше операций, чем у методов центрифугирования

 

Нет способа удаления полимера из образца экзосом

 

[9]

 

Фильтрация +

центрифугирование

 

Потенциально высокий выход

Стерильные

 

Длительный

Трудоемкий

 

[7 ]

 

 

Состав экзосом

За последние годы собрана обширная информация о компонентах внеклеточных пузырьков из различных типов клеток и жидкостей. Оказалось, что состав их белков, липидов, микроРНК и матричных РНК сильно зависит от происхождения пузырьков, а также от физиологического состояния породившей их клетки, от того, здорова она или больна [[10]]. Как правило, все экзосомы содержат аннексины, которые регулируют процессы слияния ее мембраны с мембраной клетки; ГТФазы Rab, молекулы адгезии и рецепторы, помогающие экзосоме причалить к клетке-мишени; а также белки ESCRT (эндосомного комплекса сортировки предназначенных для внутриклеточной транспортировки белков и РНК — что-то вроде аналога портовой службы маркировки-сортировки). Главный маркер экзосом — трансмембранные белки CD63, CD81 и (иногда) CD9 из семейства тетраспанинов. (CD-маркеры, или антигены, от англ. cluster of differentiation — это поверхностные белки, которые используются для идентификации клеток. Лимфоциты или стволовые клетки разных типов не всегда можно различить «на глаз», но мы можем узнать, к какому типу принадлежит клетка, если выясним, какие CD-антигены она несет.) Кроме того, экзосомы, как и клетки, несут на мембране белки главного комплекса гистосовместимости (МНС, от англ. major histocompatibility complex), которые отвечают за распознавание «своих» и «чужих» клеток и тканей, и белки теплового шока, они же белки стресса (HSP60, HSP70, HSP90). Те и другие принимают участие в связывании антигенов и предъявлении этих антигенов иммунной системе.

Рис. 2. Схематическое отображение состава и функций характерных компонентов экзосомы (в реальности экзосомы содержат порядка 4000 различных белков, более 1500 разных микроРНК и мРНК, а также фрагменты ДНК):

*красными рамками выделены молекулы, используемые для аффинного выделения и идентификации;

* зеленой рамкой -  белки гистосовместимости: MHCI- Антигеныкласса I главного комплекса гистосовместимости MHCII - Антигеныкласса II главного комплекса гистосовместимости; HLA-G - человеческий лейкоцитарный антиген G (отвечает за иммунотолерантность плаценты)

* фиолетовой рамкой -  белки, отвечающие за узнавание и сцепление с принимающей клеткой;

* серыми рамками внутреннее содержимое переносимое экзосомой: Ферменты и мышечные белки, белки теплового шока, матричные РНК, микро РНК и т.д.

 

Экзосомы как иммуномодуляторы

Способность мембранных пузырьков транспортировать информацию впервые была показана в исследованиях экзосом из В-лимфоцитов. Оказалось, что они несут на себе белки главного комплекса гистосовместимости — МНС класса II, связанные с антигенным пептидом, иными словами, конструкцию, необходимую для иммунного ответа. И несут они ее не куда-нибудь, а в специализированные Т-клетки, то есть служат посредниками при передаче. Аналогичным образом экзосомы переносят комплексы MHC класса I c пептидным антигеном из дендритных клеток в так называемые наивные Т-лимфоциты. Получив такое «письмо», Т-лимфоциты перестают быть наивными и готовы опознать антиген обидчика, а также сразиться с ним. Подобным же образом экзосомы распространяют антигены и их комплексы с MHC между дендритными клетками, благодаря чему растет число дендритных клеток, представляющих тот или иной антиген.

Если дендритная клетка незрелая или выделяет цитокины, тормозящие иммунный ответ, ее экзосомы несут подавляющие иммунитет молекулы. Это способствует развитию иммунной толерантности, противодействует воспалительным процессам, а значит, может быть полезно для лечения аутоиммунных заболеваний [[11]] .

Другой случай полезного подавления иммунной реакции — экзосомы, выделяемые клетками плаценты в кровь матери. Они несут на себе фактор FasL, ингибирующий Т-клетки и NK-клетки (от англ. natural killers — «естественные убийцы»), чем предотвращают иммунную атаку крови матери против плода. Подобные экзосомы найдены также в молозиве и молоке кормящей матери.

Кстати, сами NK-клетки тоже выделяют экзосомы, образно названные «нанопулями против опухолей». Они содержат две «молекулы-убийцы»: перфорин, который проделывает дырки в плазматической мембране клетки-мишени, и тот же самый лиганд FasL, который взаимодействует с трансмембранным белком FasR — рецептором, запускающим апоптоз.

К сожалению, инфекции и опухоли распространяются по организму и спасаются от иммунного наздора также с помощью экзосом. Появляется все больше доказательств того, что экзосомы из опухолей ингибируют иммунный ответ и содействуют ангиогенезу (образованию новых кровеносных сосудов), тем самым способствуя росту новообразования. Кроме того, опухолевые экзосомы могут провоцировать образование метастазов, активируя миграцию опухолевых клеток и подготавливая им на новом месте так называемую метастазную нишу — микроокружение, способствующее укоренению и росту. Так, микроРНК miR21 и miR29a экзосом секретируемых раковыми клетками может связываться с толл-подобными рецепторами (об этих рецепторах см. [[12]]), в окружающих их клетках иммунной системы, что приводит к активации пути NFκB ([13]].

Компания «Aethlon» разработала очистительную колонку «Hemopurifier», которая, по данным доклинических исследований invitro, позволяет очистить кровь пациента от экзосом рака молочной железы, рака яичников, метастатической меланомы, колоректального рака и лимфомы. Предполагается, что  удаление секретируемых раковыми клетками экзосом поможет улучшить результаты медикаментозного лечения [[14]  [15]], поскольку именно они считаются причиной устойчивости опухолей к терапии  [ [16]    [17]].

 

 

Перенос генетического материала 

В 2007 году было обнаружено, что экзосомы, продуцируемые тучными клетками, содержат не только белки, но и  РНК [[18]]. Это были как матричные РНК, содержащие информацию об аминокислотной последовательности белков, так и функционально активные малые РНК — некодирующие молекулы длиной около 22 нуклеотидов, которые принимают участие в регуляции экспрессии генов [ [19]].

Молекулы РНК попадают в экзосомы не случайным образом. Об этом свидетельствует тот факт, что в экзосомы почти не попадает РНК, входящая в состав рибосом. Кроме того, набор микроРНК и мРНК в экзосоме не вполне отражает содержание этих РНК в родительских клетках. Например, в клетках аденокарциномы крысы обнаружено более 8000 различных мРНК, а в экзосомах из этих клеток  их не более 1500 (тем не менее они в какой-то мере отражают состав мРНК клетки).

РНК, курсирующие с помощью экзосом от одной клетки к другой, были названы челночными, или шаттл-РНК (exosomal shuttle RNA — esRNA).

Основным механизмом информационной деятельности экзосом до последнего времени считался перенос матричной РНК, которая кодирует необходимые клетке реципиенту белки. Однако исследования последних лет показывают, что клетки общаются между собой, используя в качестве «языка» для доставки большого масштаба инструкций по согласованию, нетранслируемые последовательности как микроРНК [[20]], так и матричных РНК. Переносчиком этих инструкций очевидно и являются экзосомы.

По данным Батагова и Курочкина экзосомы секретируемые клетками человека главным образом  транспортируют фрагменты мРНК, которые обогащены 3'-нетранслируемыми участками [[21]]. На основании этого авторы выдвинули смелое предположение, что экзосомальные фрагменты мРНК могут выступать в качестве конкурирующих РНК, цель которых регулировать стабильность, локализацию  и активность трансляции мРНК в клетках-реципиентах, «поскольку 3'-нетранслируемые участки богаты элементами которые определяют место локализации мРНК [[22]] и богаты микроРНК связывающими участками».  Этим предположением они развивают гипотезу Salmena с соавт [[23]] которые предположили, что РНК-транскрипты  могут «разговаривать» друг с другом с помощью микроРНК-опосредованного языка (путем конкуренции связывания за ограниченный пул микроРНК) по схеме: РНК→ микроРНК → РНК.

Основным механизмом образования мРНК, которые обогащены 3'-нетранслируемыми участками является посттранскрипционное (а может быть и посттрансляционное) расщепление мРНК, а не инициация новой транскрипции [[24]].  Поэтому пул таких РНК можно рассматривать как «отчет» о деятельности клетки донатора экзосомы.

Интересно отметить, что по некоторым данным экзосомы содержат главным образом  не зрелые микроРНК, а их предшественники [[25]].

Передача микроРНК — один из ключевых путей взаимодействия между стволовыми клетками и их микроокружением, так называемой нишей. Так, например, экзосомы, секретируемые эндотелиальными клетками, стимулировали миграцию и ангиогенез  клеток-реципиентов перенося микроРНК miR-214 [[26]] .

Этим путем пользуются и раковые клетки. Как было отмечено выше передача микроРНК miR21 и miR29a экзосомой из раковой клетки влияет на экспрессию генов в клетке-мишени, способствуя распространению метастазов [13]. Естественно возникает вопрос: можно ли заблокировать пересылку микроРНК из больных клеток? Подсказкой может оказаться тот факт, что для образования экзосом требуются церамиды — липиды, которые входят в состав мембран и играют роль сигнальных молекул; мы их уже упоминали в начале, когда рассказывали о секреции экзосом. Подавить секрецию экзосом и таким образом заблокировать пересылку микроРНК из больных клеток удалось в опытах in vitro, подавив ингибитором активность сфингомиелиназы – фермента, который продуцирует церамиды, расщепляя сфинголипиды мембран.

Помимо РНК экзосомы могут содержать еще и мобильную ДНК, например, митохондриальную.

 Во внеклеточной жидкости, в том числе в плазме крови, присутствуют ферменты, разрушающие ДНК и РНК, поэтому молекулы — носители генетической информации должны путешествовать от одной клетки к другой внутри мембранных микропузырьков защищающих их от этих ферментов.

По сравнению с РНК клетки, РНК экзосом более стабильны и устойчивы к деградации при длительном хранении и повторных циклах замораживания и оттаивания. Полезное качество для потенциальных диагностических и лечебных препаратов!

 

Регенерация

Экзосомы, по всей видимости, играют важную роль в восстановлении поврежденных органов. Все больше данных свидетельствует о том, что внеклеточные везикулы, секретируемые из гемопоэтических стволовых клеток-предшественников, мультипотентных клеток стромы или сердечных стволовых клеток, обладают уникальными свойствами. Они защищают клетки, оставшиеся в поврежденных тканях, от апоптоза, стимулируют деление выживших клеток и рост сосудов.

За счет чего это происходит? Во-первых, мембраны этих везикул обогащены биологически активными липидами, такими, как близкий родственник церамидов сфингозин-1-фосфат. Во- вторых, на их поверхности синтезируются антиапоптозные и стимуляторные ростовые факторы и цитокины. В-третьих, они целенаправленно доставляют в поврежденные ткани мРНК, регуляторные микроРНК и ферменты, и вся эта «гуманитарная помощь» повышает способности клеток к регенерации.

Например, мезенхимальные стволовые клетки посылают с помощью экзосом в поврежденные клетки канальцев почек матричную РНК рецептора инсулиноподобного ростового фактора-1. В клетках начинается синтез этого рецептора, и регенерация идет активнее.

Аналогичным образом транспортировка экзосомами мРНК TGF-β1 при повреждении дает начало активации процессов регенерации и восстановлению тканей [[27]].

 Подобные механизмы перепрограммирования поврежденных клеток стволовыми могут быть задействованы и при инфаркте миокарда. В экспериментах на животных даже однократное введение экзосом мезенхимальных стволовых клеток уменьшает размер инфаркта и улучшает состояние подопытных. Очевидно, экзосомы восполняют дефицит ферментов, важных для снабжения клетки энергией, а значит, и для скорейшей реабилитации сердечной мышцы [ [28]  [29]].

 

Развитие организмов и старение 

Недавно было обнаружено, что длительность жизни нейронов мозга зависит от среды, в которой они находятся. Если пересадить нейроны мыши в мозг крыс, живущих намного дольше мышей, продолжительность жизни этих нервных клеток может более чем вдвое превысить средний срок, отмеренный природой мышам. Исследования методом гетерохронного парабиоза, при котором кровеносные системы двух животных разного возраста объединяют хирургическим путем, показали, что при этой операции старое животное молодеет, а молодое, наоборот, стареет. Очевидно, возрастное снижение активности клеток может быть результатом воздействия циркулирующих в крови факторов, состав которых меняется с возрастом. Очистка крови с помощью сепаратора показала, что действующее начало сосредоточено в зоне частиц совпадающих по размерам с экзосомами.

В недавно опубликованном обзоре Ден Сюй из Китая и Хидетоши Тахара из Японии [[30]] обосновали гипотезу о том, что важнейшую роль в координации процессов клеточного старения выполняют экзосомы, а точнее, переносимые ими микроРНК. Некоторые из них могут способствовать старению, запуская сигнальные пути, ведущие к одряхлению организма, другие защищают от этих процессов. Экзосомы из состарившихся клеток с помощью своей микроРНК так изменяют микроокружение, что оно начинает благоприятствовать возрастным заболеваниям, понижению иммунитета, воспалению и нарушению функций различных органов. В обзоре приведен список микроРНК, которые предположительно способствуют, или же противодействуют старению. 

В связи с вышеизложенным интересно отметить, что, как правило, биологическая и терапевтическая активность, а также способность к секреции экзосом мезенхимальных стволовых клеток обратно коррелируют со стадией развития донора [ [31]].

Диагностика 

Bсследования экзосом имеют огромную практическую значимость. Например, они могут сказать многое о состоянии организма. Из экзосом, содержащихся в плазме крови, моче и других биожидкостях, можно получить микроРНК для диагностики. Как уже говорилось, липидная оболочка защищает РНК от агрессивных ферментов, поэтому возможность их деградации при транспортировке и хранении образцов невелика. Результаты такого анализа помогут не только поставить диагноз, но и определить стадию заболевания, выяснить, прогрессирует ли оно или вошло в стадию ремиссии, проверить эффективность лечения.

Экзосомы содержат белки, микроРНК и матричную РНК той клетки, из которой они произошли. Это позволяет использовать их для фенотипирования и идентификации клеток. Они многое могут рассказать и о состоянии клетки. Так, повышенный уровень микроРНК-155 характерен при наличии провоспалительных макрофагов и атеросклеротических поражений. МикроРНК семейства Let-7 в экзосомах может свидетельствовать об активном размножении клеток, а значит, о растущей опухоли. Появление в плазме крови типичной для сердечной мышцы микроРНК-208а и изменения уровня некоторых других микроРНК могут быть использованы для ранней диагностики повреждения миокарда. Характерный состав микроРНК имеют также экзосомы из нейронов, зараженных прионами — инфекционными белками, вызывающими тяжелые заболевания центральной нервной системы, такие, как куру или «коровье бешенство». И подобных примеров, демонстрирующих возможности диагностики по экзосомам, с каждым днем становится все больше.

Еще один плюс диагностики по экзосомам — вместо весьма болезненной и порой небезопасной хирургической биопсии тканей можно исследовать жидкости и получить ту же информацию. Это особенно важно при диагностике рака головного мозга, например глиомы, когда проведение множества биопсий может быть опасным для жизни пациента. Группа американских исследователей разработала высокочувствительный аналитический прибор для быстрого изучения микровезикул непосредственно в образцах крови пациентов [[32]]. Кровь пропускают через микрожидкостной чип, в котором микровезикулы метят моноклональными антителами, связанными с магнитными наночастицами, а затем выявляют с помощью миниатюрной детекторной системы, использующей ядерный магнитный резонанс. Исследование РНК экзосом, выделенных из крови и спинномозговой жидкости, позволит ученым проводить тест на наличие опухоли и наблюдать за ее изменениями, не проводя биопсию. Всего из 0,1—0,5 мл сыворотки крови или другой биологической жидкости можно получить с помощью набора EXO50 Exosome Diagnostics достаточно РНК [[33]] или белка экзосом, чтобы провести экспресс-диагностику. Анализ может быть выполнен как на свежих, так и на замороженных образцах жидкости, при этом специальных методов сохранения  не требуется.

Специалисты компании «Exosome Diagnostics» (США) разработали набор для выявления рака предстательной железы, обладающий точностью 75%. Первые наборы для диагностики по образцам экзосом, полученных из мочи, можно будет приобрести уже в этом году. В то же время компания «Exosome Sciences, Inc» совместно с «Aethlon Medical, Inc.» производит тест ELLSA ™ (Enzyme Linked Lectin Specific Assay) для идентификации по специфичным экзосомам вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), туберкулеза (ТБ) и различных форм рака, включая колоректальный рак, рак яичников, молочной железы, меланому и лимфому. Не отстает от них эстонская компания «HansaBioMed» в каталоге которой  можно найти различные  продукты для исследования экзосом: иммунопланшеты на 96 ячеек, иммуногранулы, флаконы с лиофилизованными стандартами экзосом, антитела, наборы для экстракции РНК и изучения протеома экзосом.

От клеточной терапии к терапии экзосомами

Исследованиями последних лет показано,что экзосомы могут быть успешно использованы не только для диагностики, но и для лечения. Далеко не полный список возможного терапевтического применения уже включает иммунотерапию, изготовление вакцин, модуляторы ангиогенеза, целевую доставку в ткани-мишени различных лекарственных препаратов (в том числе «скоропортящихся»: ферментов, препаратов на основе РНК: микроРНК, матричных РНК, малых интерферирующих РНК [ [34]]). Действительно,  экзосомы по многим параметрам являются идеальным средством доставки лекарств. Они способны нести достаточно большие порции лекарственных препаратов, и при этом благодаря липидной оболочке предохраняют свое содержимое от разбавления и разрушения, что особенно важно, если лекарством является фермент или нуклеиновая кислота. Могут переносить свое содержимое через плазматическую мембрану клетки. Кроме того, эти мембранные пузырьки, не токсичны, так как самой природой предназначенны для межклеточного обмена, хорошо переносятся организмом, о чем свидетельствует их присутствие в биологических жидкостях. Благодаря рецепторам на их поверхности они избирательно находят клетки-мишени, тем самым повышая эффективность переноса лекарственных препаратов, белков и РНК и снижая возможность побочных эффектов [[35]]. Например, если препарат экзосом, заключающих в себе противовоспалительное лекарство, просто закапать в нос, лекарство будет доставлено в конкретные клетки мозга, то есть сможет пересечь гематоэнцефалический барьер. Важно отметить, что при необходимости можно изменить состав рецепторов на поверхности экзосомы и направить ее по новому адресу, нацелить на другие клетки. 

 Примеры терапии с помощью экзосом

Иммунотерапия. Экзосомы, содержащие опухолевые антигены внутри и (или) на поверхности мембраны, выделяют из различных источников — полостной жидкости пациента, культуры опухолевых клеток или культуры иммунных клеток, а затем вводят пациенту, чтобы вызвать целенаправленный иммунный ответ

 

Терапия интерферирующими РНК. Методами биоинженерии была создана культура дендритных клеток, синтезирующих химерную конструкцию, — мембранный белок Lamp2b сделали носителем пептида, узнающего нейроны. В экзосомы, полученные из таких дендритных клеток, загружают с помощью электропорации малые интерферирующие РНК — siРНК (класс двухцепочечных РНК, отличных от микроРНК, но имеющих сходную роль в регуляции). Внутривенная инъекция таких экзосом, ориентированных на поиск нейронов и содержащих siРНК, снижает активность гена-мишени в нервных клетках

 

Лекарственная терапия. Молекулы лекарства размещают внутри экзосомы или на ее мембране — это облегчает их целевую доставку и минимизирует деградацию

 

Вышеприведенными путями терапевтического применения экзосом список, как мы уже отметили выше, не заканчивается. На очереди их применение взамен клеточной терапии!

Человеческие мезенхимальные стволовые клетки обладают способностями вызывать иммуносупрессию и активировать процессы регенерации. Поэтому они интенсивно исследуются на предмет их применения для лечения сердца, почек, нервной ткани, суставов и регенерации костей, а также терапии воспалительных заболеваний и подавления реакции отторжения при трансплантации. Клинические исследования на животных показали, что терапевтическая эффективность мезенхимальных стволовых клеток опосредована не их дифференцировкой и включением в ткань мишень, а секретируемыми ими трофическими факторами терапевтического воздействия, одним из которых являются экзосомы. Исходя из того, что в основе терапевтической эффективности мезенхимальных стволовых клеток может лежать терапевтическое воздействие продуцируемых ими экзосом [25], которые, в отличие от клеток, легко  переносят замораживание и оттаивание, было предложено перейти от клеточной терапии на терапию экзосомами. Для массового производства экзосом предполагается использовать культуры человеческих мезенхимальных стволовых клеток, обладающих способностью к пролиферации. Уже удалось создать постоянную «промышленную» линию таких клеток, которая с течением времени не теряет способности к делению, полностью сохраняя и способность секретировать экзосомы [[36]]. Важно отметить, что в отличие от клеток экзосомы не могут сами размножаться и поэтому не могут выйти из под контроля, не могут образовывать опухоли, а значит терапия экзосомами более безопасна, чем клеточная терапия.

Перспективное терапевтическое средство представляют собой и экзосомы из культур NK-клеток — как нетрудно догадаться, потенциальное оружие против опухолей.

Конечно, есть и нерешенные проблемы. Коль скоро экзосомы несут на себе белки главного комплекса гистосовместимости, аллогенные, то есть взятые от другого человека экзосомы теоретически могут вызывать у пациента иммунный ответ, несмотря на иммуносупрессивную активность (хотя по некоторым данным даже межвидовые переносы экзосом из мезенхимальных стволовых клеток, например от мыши крысе, не сопровождаются иммунной реакцией). Ключ к решению — вероятно, тщательный подбор донорских клеток для производства экзосом, а также получение культур аутологичных (собственных) мезенхимальных стволовых клеток пациента из индуцированных стволовых клеток.

Кроме того необходимо достичь некоторой стандартизации методологических подходов (особенно методов выделения микровезикул) чтобы можно было сравнивать результаты полученные разными исследовательскими лабораториями [ [37]].

В заключение следует отметить, что изучение экзосом и других секретируемых микровезикул является быстро развивающейся новой областью как фундаментальных, так и клинических исследований, цель которых получить более полное представление о роли экзосом и их функциях в физиологических и патологических условиях. Вышеизложенное свидетельство того что эта область исследований обещает беспрецедентные возможности для открытия механизмов межклеточного взаимодействия и разработки новых способов диагностики и лечения.

Литература для дальнейшего чтения

Гусаченко О. Н., Зенкова М. А., Власов В. В. (2013) Нуклеиновые кислоты экзосом: маркеры заболеваний и молекулы межклеточной коммуникации. Биохимия. 78(1), 5—13.

Shifrin, D. A., Beckler, M. D., Coffey, R. J., & Tyska, M. J. (2013). Extracellular vesicles: communication, coercion, and conditioning. Molecular biology of the cell, 24(9), 1253-1259. DOI: 10.1091/mbc.E12-08-0572

Marcus, M. E., & Leonard, J. N. (2013). FedExosomes: Engineering Therapeutic Biological Nanoparticles that Truly Deliver. Pharmaceuticals, 6(5), 659-680. doi:10.3390/ph6050659

Lopez-Verrilli, M. A., & Court, F. A. (2013). Exosomes: mediators of communication in eukaryotes. Biological research, 46(1), 5-11. doi: 10.4067/S0716-97602013000100001.

Джагаров Д.Э.

Использованная литература

 



[1] Bloemendal, S., & Kück, U. (2013) [http://link.springer.com/article/10.1007/s00114-012-0988-z] Cell-to-cell communication in plants, animals, and fungi: a comparative review. Naturwissenschaften, 100(1), 3-19. DOI: 10.1007/s00114-012-0988-z

[2] Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., & Johnstone, R. M. (1985) [http://jcb.rupress.org/content/101/3/942.abstract] Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes. The Journal of cell biology, 101(3), 942-948.

[3] Corrado C, Raimondo S, ChiesiA, Ciccia F, De Leo G, Alessandro R. (2013) [http://www.mdpi.com/1422-0067/14/3/5338] Exosomes as intercellular signaling organelles involved in health and disease: basic science and clinical applications. Int J Mol Sci.; 14(3), 5338-5366; doi:10.3390/ijms14035338

[4] Sharma, P., Schiapparelli, L., & Cline, H. T. (2013) [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959438813001530] Exosomes function in cell–cell communication during brain circuit development. Current opinion in neurobiology. http://dx.doi.org/10.1016/j.conb.2013.08.005

[5] Svensson, K. J., Christianson, H. C., Wittrup, A.,et al. & Belting, M. (2013) [http://www.jbc.org/content/288/24/17713.short] Exosome Uptake Depends on ERK1/2-Heat Shock Protein 27 Signaling and Lipid Raft-mediated Endocytosis Negatively Regulated by Caveolin-1. Journal of Biological Chemistry, 288(24), 17713-17724.  doi:10.1074/jbc.M112.445403

[6] Lopez-Verrilli, M. A., & Court, F. A. (2013) [http://www.scielo.cl/pdf/bres/v46n1/art01.pdf] Exosomes: mediators of communication in eukaryotes. Biological research, 46(1), 5-11. doi: 10.4067/S0716-97602013000100001 

[7] Thery,  C.;  Amigorena,  S.;  Raposo,  G.;  Clayton,  A. (2006) [http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/0471143030.cb0322s30/abstract] Isolation  and  characterization  of  exosomes from  cell  culture  supernatants  and  biological  fluids.  Curr.  Protoc.  Cell  Biol.,  Chapter  3, Unit 3.22. DOI: 10.1002/0471143030.cb0322s30

[8] Lamparski, H.G.; Metha-Damani, A.; Yao, J.Y.; et al, & Le Pecq, J.B. (2002) [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022175902003307]

Production  and  characterization  of  clinical  grade  exosomes  derived  from  dendritic  cells.

J. Immunol. Methods, 270, 211–226.

[9] Taylor, D.D.; Zacharias, W.; Gercel-Taylor, C. (2011) [http://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-61779-068-3_15] Exosome  isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods Mol. Biol., 728, 235–246. DOI: 10.1007/978-1-61779-068-3_15

[10] Choi, D.-S., Kim, D.-K., Kim, Y.-K. and Gho, Y. S. (2013) [http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/pmic.201200329/abstract] Proteomics, transcriptomics and lipidomics of exosomes and ectosomes. Proteomics, 13: 1554–1571. doi: 10.1002/pmic.201200329

[11] Weifan YinSong OuyangYi LiBo XiaoHuan Yang   (2013) [http://link.springer.com/article/10.1007/s10753-012-9539-1] Immature Dendritic Cell-Derived Exosomes: a Promise Subcellular Vaccine for Autoimmunity.  Inflammation,  36(1),  232-240  DOI 10.1007/s10753-012-9539-1

[13] Fabbri M., Paone A., Calore F., Galli R., Gaudio E., Santhanam R., et al. (2012) [http://www.pnas.org/content/109/31/E2110.short] MicroRNAs bind to Toll-like receptors to induce prometastatic inflammatory response.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E2110–2116. doi: 10.1073/pnas.1209414109

[14]   [https://www.google.com/patents/WO2007103572A2?cl=en] Extracorporeal removal of microvesicular particles. Патент WO 2007103572 A2

[15] [https://www.google.com/patents/EP2495025A1?cl=en] Filter for the removal of micro-vesicles from biological fluids, methods and devices using such a filter. Патент EP 2495025 A1

[16] Raz, A., Goldman, R., Yuli, I., & Inbar, M. (1978). Isolation of plasma membrane fragments and vesicles from ascites fluid of lymphoma-bearing mice and their possible role in the escape mechanism of tumors from host immune rejection. Cancer Immunology, Immunotherapy, 4(1), 53-59. DOI 10.1007/BF00205571

[17] Pucci, F., & Pittet, M. J. (2013). Molecular Pathways: Tumor-derived microvesicles and their interactions with immune cells in vivo. Clinical Cancer Research, 19(10), 2598-2604.  doi: 10.1158/1078-0432.CCR-12-0962

[18] Valadi H, Ekstrom K, Bossios A, Sjostrand M, Lee JJ, Lotvall JO (2007) [http://www.nature.com/ncb/journal/v9/n6/full/ncb1596.html] Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol 9: 654–659

[19] Doxakis E.( 2013) [http://www.mdpi.com/1422-0067/14/8/16280?utm_source=dlvr.it&utm_medium=twitter] Principles of miRNA-Target Regulation in Metazoan Models. International Journal of Molecular Sciences; 14(8), 16280-16302; doi:10.3390/ijms140816280

[20] Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., & Bartel, D. P. (2010). Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature,466(7308), 835-840. doi:10.1038/nature09267

[21] Batagov, A. O., & Kurochkin, I. V. (2013) [http://link.springer.com/article/10.1186/1745-6150-8-12] Exosomes secreted by human cells transport largely mRNA fragments that are enriched in the 3′-untranslated regions. Biology direct, 8(1), 1-8. DOI: 10.1186/1745-6150-8-12

[22] Andreassi, C., & Riccio, A. (2009) [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S096289240900141X] To localize or not to localize: mRNA fate is in 3′ UTR ends. Trends in cell biology, 19(9), 465-474. doi:10.1016/j.tcb.2009.06.001

[23] Salmena L, Poliseno L, Tay Y, et al.( 2011) [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867411008129] A ceRNA hypothesis: the Rosetta Stone of a hidden RNA language? Cell;146:353-8. http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2011.07.014

[24] Mercer TR, Wilhelm D, Dinger ME, Soldà G, Korbie DJ, Glazov EA, Truong V, Schwenke M, Simons C, Matthaei KI, Saint R, Koopman P, Mattick JS: Expression of distinct RNAs from 3′ untranslated regions. Nucleic Acids Res 2011, 39:2393-2403.

[25] Chen, T. S., & Lim, S. K. (2013) [http://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-62703-453-1_6] Measurement of Precursor miRNA in Exosomes from Human ESC-Derived Mesenchymal Stem Cells. In Circulating MicroRNAs (pp. 69-86). Humana Press. DOI: 10.1007/978-1-62703-453-1_6

[26] van Balkom, B. W., De Jong, O. G., Smits, M., et al. & Verhaar, M. C. (2013) [http://bloodjournal.hematologylibrary.org/content/121/19/3997.short] Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells. Blood, 121(19), 3997-4006. doi: 10.1182/blood-2013-02-478925 

[27] Borges, F. T., Melo, S. A., Özdemir, B. C., et al. & Kalluri, R. (2013) [http://jasn.asnjournals.org/content/24/3/385.short] TGF-β1–Containing Exosomes from Injured Epithelial Cells Activate Fibroblasts to Initiate Tissue Regenerative Responses and Fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology, 24(3), 385-392 doi:10.1681/ASN.2012101031

[28] Arslan, F., Lai, R. C., Smeets, M. B et al.& de Kleijn, D. P. (2013) [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1873506113000032] Mesenchymal stem cell-derived exosomes increase ATP levels, decrease oxidative stress and activate PI3K/Akt pathway to enhance myocardial viability and prevent adverse remodeling after myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem cell research, 10(3), 301-312. http://dx.doi.org/10.1016/j.scr.2013.01.002

[29] Lai, R. C., Yeo, R. W. Y., Tan, K. H., & Lim, S. K. (2013) [http://www.futuremedicine.com/doi/abs/10.2217/rme.13.4] Mesenchymal stem cell exosome ameliorates reperfusion injury through proteomic complementation. Regenerative medicine, 8(2), 197-209. doi:10.2217/rme.13.4

[30] Xu, D., & Tahara, H. (2012) [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X12002323] The role of exosomes and microRNAs in senescence and aging. Advanced drug delivery reviews.  65(3), 368–375   doi: 10.1016/j. addr.2012.07.010

[31] Chen TS, Yeo RWY, Arslan F, et al. (2013) [http://www.omicsonline.org/efficiency-of-exosome-production-correlates-inversely-with-the-developmental-maturity-of-msc-donor-2157-7633.1000145.pdf] Efficiency of Exosome Production Correlates Inversely with the Developmental  Maturity of MSC Donor. J Stem Cell Res Ther 3(3), 145. doi:10.4172/2157-7633.1000145

[32] Shao, H., Chung, J., Balaj, L, et al. & Lee, H. (2012) [http://www.nature.com/nm/journal/v18/n12/full/nm.2994.html] Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy. Nature medicine. 18,  1835–1840 doi:10.1038/nm.2994

[33]  Zeringer, E., Li, M., Barta, T., et al. & Vlassov, A. V. (2013) [http://www.wjgnet.com/2222-0682/full/v3/i1/11.htm] Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes. World J Methodol., 3(1): 11-18   doi: 10.4329/wjm.v3.i1.11.

[34] Lakhal, S., El Andaloussi, S., O’Loughlin, A. J., Li, J., & Wood, M. M. (2013) [http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-1-4614-4744-3_9] RNAi Therapeutic Delivery by Exosomes. In RNA Interference from Biology to Therapeutics (pp. 185-205). Springer US. DOI: 10.1007/978-1-4614-4744-3_9

[35] Suntres, Z. E., Smith, M. G., Momen-Heravi, F., et al. & Kuo, W. P. (2013) [http://www.intechopen.com/journals/exosomesandmicrovesicles/therapeutic-uses-of-exosomes] Therapeutic Uses of Exosomes. Exosomes and Microvesicles. InTech — Open Access Company 1(5)  DOI: 10.5772/56522

[36]. Yeo, R. W. Y., Lai, R. C., Zhang, B., Tan, S. S., Yin, Y., Teh, B. J., & Lim, S. K. (2012) [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X12002128] Mesenchymal stem cell: an efficient mass producer of exosomes for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev.; 65(3), 336-41. doi: 10.1016/j.addr.2012.07.001

[37] Witwer, K. W., Buzás, E. I., Bemis, L. T., et al. & Hochberg, F. (2013) [http://www.journalofextracellularvesicles.net/index.php/jev/article/view/20360] Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles,  2: 20360 - http://dx.doi.org/10.3402/jev.v2i0.20360

 

 

 

 

 

 

 

 

Контакт

ipsc-lab@mail.ru